В детстве снялся в рекламе детских товаров, но настоящая актёрская карьера Эклса началась в 1996 году, когда он появился в эпизодических ролях в таких телесериалах, как «Мистер Роудс», «Школа в Ласковой долине», и «Сибилл». В 1997 году он получил роль Эрика Брэйди в сериале телеканала NBC "Дни нашей жизни", но в 2000 году актёр ушёл из этого сериала, чтобы сняться в мини-сериале «Блондинка», повествующем о жизни Мэрилин Монро. Дженсен также проходил прослушивание на роль Кларка Кента в сериале "Тайны Смолвиля", но эта роль досталась Тому Уэллингу. В 2001 году Дженсен Эклс снялся в телесериале Джеймса Кэмерона "Тёмный ангел" (телеканал Fox) в эпизодической роли Бена/Х5-493, психопата и серийного убийцы, «брата» главной героини Макс/Х5-452. Его персонаж погибает, но Дженсен возвращается во 2-м сезоне в роли близнеца Бена — Алека/Х5-494 - и остаётся в сериале до его отмены в 2002 году.
2003 год стал для него плодотворным: он присоединился к актёрскому составу популярного сериала телеканала The WB "Бухта Доусона", где сыграл роль Си Джея, возлюбленного Джен Линдли. После этого Дженсен снялся в нескольких сериях так и не вышедшего в эфир телесериала «Спокойная жизнь» телеканала Fox перед тем, как его съёмки неожиданно прекратили. Эклсу предлагали роль возлюбленного Элайзы Душку во 2-м сезоне сериала "Вернуть из мёртвых", но в 2004 году он вернулся в Ванкувер, чтобы сыграть роль Джейсона Тига, возлюбленного Ланы Лэнг в телесериале «Тайны Смолвиля». В 2005 году Дженсен сыграл главную роль в фильме "Пожиратель душ" вместе со своим отцом.
В 2005 году Дженсен получил главную роль Дина Винчестера в мистическом сериале "Сверхъестественное", в котором также в главной роли снялся Джаред Падалеки. В 2007 году Дженсен был утверждён на роль Пристли в фильме "Десятидюймовый герой". В июне 2007 года Дженсен выступил на сцене театра Casa Mañana (Техас) вместе с Лу Филлипсом в спектакле «Несколько хороших парней», где он сыграл роль лейтенанта Дэниэла Кэффи, которого исполнил Том Круз в киноверсии этой постановки в 1992 году. Это был первый опыт Эклса на театральной сцене.
В 2010 году состоялся режиссёрский дебют Дженсена - он снял 4-ю серию 6-го сезона сериала «Сверхъестественное» - «Выходные у Бобби», после чего срежиссировал ещё несколько серий разных сезонов.
После трех лет знакомства актёр обручился с актрисой и моделью Дэннил Харрис в ноябре 2009 года. Пара поженилась 15 мая 2010 года в Далласе. Их первый ребенок, дочь, родилась в мае 2013 года. В августе 2016 года пара объявила, что ждет близнецов, мальчика и девочку, которые родились в декабре.
Эклс является совладельцем пивоварни Family Business Beer Company в Дриппинг-Спрингс, штат Техас, вместе с женой. Название пивоварни является отсылкой к сериалу «Сверхъестественное» («семейный бизнес» - слоган сериала).