Джон Уилкс Бут, по семейной традиции, был актёром шекспировского репертуара. В семнадцать лет дебютировал на театральной сцене и скоро стал одним из самых известных актёров своего времени.
Был ярым противником аболиционистов, которые хотели покончить с рабством в США. В 1859 году он присутствовал на казни борца против рабства Джона Брауна — Бут был одним из солдат, охранявших место казни, и стоял рядом с эшафотом. Во время Войны Севера и Юга стал тайным агентом Конфедерации, доставлявшим ей контрабандные медикаменты. Участвовал в антиправительственном заговоре, участники которого обдумывали сначала похищение президента Авраама Линкольна, затем, ближе к окончанию войны — убийство его и основных членов правительства США.
14 апреля 1865 года во время спектакля в театре Форда в Вашингтоне выстрелом из пистолета смертельно ранил в голову президента Линкольна. Бут не был занят в спектакле, шедшем в тот день, однако часто там бывал у своих друзей-актёров и хорошо знал как здание, так и репертуар. Во время самой смешной сцены комедии «Мой американский кузен» он вошёл в ложу президента и выстрелил в него после одной из реплик с тем расчётом, чтобы звук выстрела был заглушён взрывом хохота. Считается, что Бут при этом воскликнул: «Такова участь тиранов » ( "Sic semper tyrannis!" — девиз Виргинии, в свою очередь повторяющий слова, которые в момент гибели Юлия Цезаря якобы произнёс другой известный убийца главы государства с созвучным Джону Уилксу Буту именем Марк Юний Брут).
В возникшей суматохе ему удалось скрыться, но поздним вечером в среду 26 апреля 1865 года он был настигнут полицией в штате Виргиния в амбаре, где скрывался с одним из подручных. Амбар подожгли, Бут вышел, вооружённый револьвером, и в этот момент был смертельно ранен в шею сержантом Бостоном Корбеттом. Последние слова, которые были сказаны Джоном Бутом: «Передайте моей матери, что я умер, сражаясь за свою страну».